OPU işleminde toplanan yumurtalar COC(Cumulus oocyte complex) olarak tanımlanan, yumurtanın gelişim aşamasında ve fertilizasyona kadarki süreçte gelişimini ve canlılığını destekleyen binlerce kümülüs hücresi ile çevrili olarak gelmektedir. Planlanan fertilizasyon yöntemine bağlı olarak, işlem öncesinde bu hücrelerin yumurtadan ayrılması gerekebilir. Eğer fertilizasyon için IVF yöntemi planlanıyorsa yumurtalara herhangi bir müdahale yapılmaz. Eğer ICSI planlanıyor ise, olgun yumurtaların ve yumurta kalitelerinin tanımlanabilmesi için kümülüs hücreleri denudasyon olarak tanımlanan bir işlem ile yumurtadan ayrılır. Denudasyon işleminde öncelikle yumurtalar, yumurtayı çevreleyen zona pellucida tabakası ile kümülüs hücreleri arasındaki bağları zayıflatıcı etkisi olan, hyaluronidaz isimli bir enzime maruz bırakılırlar. Bu kısa süreli maruziyet sonrasında yumurtalar, çapları büyükten küçüğe azalan boyutlarda özel pipetlerle muamele edilerek kümülüs hücreleri mekanik olarak uzaklaştırılır. Bu işlem sonucunda yumurtalar sadece zona pellucida tabakası ile çevrili olarak kalırlar. Yapılan mikroskobik değerlendirmede olgun ve olgun olmayan yumurtalar tespit edilerek, mikroenjeksiyon işlemine kadar bekletilecekleri kültür sıvılarına alınır ve gerekli ortam koşullarını sağlayan inkübatörlere kaldırılır.

Embriyoloji laboratuvarlarında, yumurtanın sperm ile döllenmesini sağlamak amacıyla IVF ve ICSI olarak adlandırılan iki farklı yöntem kullanılır;

IVF (In vitro Fertilization):

Tüp bebek tedavilerinde döllenmeyi sağlamak amacıyla kullanılan ilk yöntem olup, ilk olarak 1978 senesinde fizyolog Robert Edwards tarafından İngiltere’de başarıyla uygulanmıştır. Bu yöntemde, androloji laboratuvarı tarafından hazırlanan spermler embriyoloji laboratuvarında kümülüsleri temizlenmemiş yumurtalar (COC) ile aynı kültür ortamında bir araya getirilerek spermin yumurtayı doğal olarak döllemesi beklenir. IVF uygulamasında sadece dölleme kapasitesi olan spermlerin yumurtaya girişi mümkün olduğu için doğal bir seçilim söz konusudur. Fakat bu durum, spermlerin dölleme potansiyellerinin yeterli değerlendirilmediği durumlarda yüksek oranda fertilizasyon başarısızlığına da yol açabilmektedir. Bu nedenle IVF işlemi uygulaması için doğru laboratuvar seçimi önem kazanmaktadır. IVF uygulamasında döllenme başarısızlığı yumurtaya bağlı sebeplerle de meydana gelebilmektedir. Bu nedenle yaygın yaklaşım, IVF planlanan ve çok sayıda yumurta toplanan vakalarda yumurtaların bir kısmında ICSI yöntemi kullanılmasıdır. IVF işleminde yaygın uygulama oosit başına 50.000-100.000 arası ileri hareketli spermin oositin bulunduğu kültür ortamına inseminasyonu şeklindedir. Daha az sayıda sperm kullanımı fertilizasyon başarısızlığına, daha çok sayıda sperm kullanımı ise polispermi olarak tanımlanan, birden fazla spermin yumurtayı döllemesine yol açabilir. Bu şekilde döllenen yumurtalar genetik olarak anormal embriyo gelişimine yol açacağı için, gelişen embriyolar transfer için kullanılamaz. İnseminasyon sonrası inkübasyon (inkübatörde bekleme) süresi laboratuvarların tercihine göre değişmekle birlikte, 2-4 saat ya da 18 saat olarak uygulanır. Kısa inkübasyonda süre bitiminde yumurtlar pipetleme yoluyla mekanik olarak temizlendikten sonra taze kültür sıvısı içerisinde tekrar inkübasyona bırakılır ve ertesi gün (14-16 saat sonra) fertilizasyon kontrolü yapılır. Uzun inkübasyonda ise yumurtalar aynı şekilde temizlendikten hemen sonra fertilizasyon kontrolü yapılabilir.

ICSI-Mikroenjeksiyon (Intra Cytoplasmic Sperm Injection):

IVF uygulaması ile döllenme sağlama imkanı bulunmayan, sperm parametreleri (sayı, hareketlilik) düşük olan, şiddetli sperm morfolojik defektleri bulunan ya da testiküler yoldan sperm elde edilen vakalarda kullanılmak üzere geliştirilen bir yöntemdir. İlk olarak 1990 senesinde Prof. Gianpiero D. Palermo tarafından Brüksel’de başarıyla uygulanmıştır. IVF işleminden farklı olarak, ICSI işleminin uygulanabilmesi için laboratuvarda belirli donanımların bulunması ve uygulayacak personelin bu konuda eğitimli ve yeterli beceriye sahip olması şarttır. İşlem inverted mikroskop olarak adlandırılan, klasik mikroskopların tersine objektifleri üstte değil alt tarafa (inverted) yerleştirilmiş mikroskoplarda uygulanır. Bu dizayn sayesinde, laboratuvarda saydam kültür kapları içerisinde bulundurulan canlı hücreler 3 boyutlu olarak görüntülenebilmektedir. ICSI işleminde kullanılan mikropipet olarak adlandırılan ve biri yumurtayı tutmak (holding pipeti) ve diğeri de spermi yumurta içerisine enjekte etmek (mikroenjeksiyon pipeti) için kullanılan pipetler, mikroskoba monte mikromanipulatör olarak adlandırılan özel bir cihaz yardımıyla kontrol edilirler. Ayrıca tüm bu düzenek, işlem esnasında zararlı olabilecek titreşimleri engellemek amacıyla antivibrasyon(titreşim önleyici) bir masa üzerinde bulundurulmalıdır.

Başarılı bir ICSI uygulaması için aşağıda belirtilen şartların sağlanması ve değişkenlerin düzenli kontrolü şarttır;

• İşlemin mutlaka antivibrasyon masa üzerinde gerçekleştirilmesi
• Oosit morfoloji değerlendirmesi ve en önemlisi mikroenjeksiyon için morfolojik olarak en düzgün spermlerin seçilebilmesi için inverted mikroskobun görüntü ayarlarının yeterli seviyede olması ve embriyoloğun bu ayarlarla ilgili yeterli bilgiye sahip olması
• Mikroskobun, içerisinde ICSI uygulanacak sperm ve yumurtalar bulunan kabın yerleştirildiği, ısıtmalı cam yüzeyinin sıcaklığının uygun olması (kap içerisinde 37 C sağlayacak şekilde)
• Yumurta ve spermlerin işlem esnasında hasar görme riskini minimize etmek için doğru pipet seçimi ve pipetlerin mikromanipülatöre doğru açılarda (mikroskop eksenine 35 derece açı yapacak şekilde) ve birbirlerine paralel olacak şekilde yerleştirilmesi
• Eğer hidrolik mikromanipulatör sistemi kullanılıyor ise sistemin bakım ve kontrollerinin her işlem öncesinde tekrarlanması
• En önemlisi işlemi uygulayacak embriyoloğun tüm bu konularda yeterli bilgi, beceri, tecrübeye sahip olması.

ICSI işlemi çok hassas bir mikrocerrahi işlemidir ve yukarıda bahsedilen şartların yeterli seviyede sağlanmaması halinde işlem sonrasında yüksek oranda fertilizasyon başarısızlığı, yumurtaların dejenerasyonu(canlılığını kaybedecek şekilde hasar görmesi), embriyo gelişimi ve kalitesinde problem gözlenmesi olasıdır.

Tedavi için başvuran erkekte aşağıda belirtilen endikasyonların bulunması halinde fertilizasyon amacıyla mutlaka ICSI yöntemi tercih edilmelidir;

• Rutin semen analizi parametrelerinin IVF için yetersiz olması
• Şiddetli sperm morfolojik defektleri (globozoospermi, megalo-pinhead sperm, kuyruk defekti-fibröz kılıf displazileri, total immotil sperm)
• Spermin zona pellucida’ya bağlanmasını engelleyebilecek minimal morfolojik defektler (akrozomal şekil bozukluğu, irregüler akrozomal dağılım)
• Ejakulatla sperm elde edilmesini engelleyen durumlar, testiküler sperm kullanımını gerektiren obstrüktif, nonobstrüktif azospermi durumları
• Önceki denemelerinde düşük IVF/ICSI fertilizasyonu ya da total fertilizasyon başarısızlığı öyküsü

ICSI işleminde sadece olgun olduğu tespit edilen yumurtalar kullanılır. İşlem için bahsedilen donanım ve şartlarda, yumurta başına bir adet olacak şekilde ileri doğru hızlı hareketli ve morfolojik olarak en düzgün spermler seçilip mikroenjeksiyon pipetiyle alınır ve sperm hareketliliğini yavaşlatan bir solüsyon içerisine aktarılarak burada sperm kuyruğu pipet darbesi ile kırılır. Bu işlemin amacı sperm kuyruğunu çevreleyen tabakaya (fibröz kılıf) ve içerisindeki hücre zarına hasar vererek, sperm sitoplazması içerisindeki oosit aktivasyon faktörü olarak tanımlanan ve oositin moleküler düzeyde spermin girişini algılamasını ve döllenmeyi sağlayacak zincir reaksiyonları başlatmasını sağlayan protein yapılarının (phospholipase C) oosit sitoplazmasına çıkışını sağlamaktır. İşlemin bitiminde yumurtalar taze kültür sıvısı içerisine aktarılarak fertilizasyon kontrolüne kadar inkübasyona bırakılır.

Fertilizasyon kontrolü IVF/ICSI işleminden 10-18 saat kadar sonra inverted mikroskop ile yapılır. Bu kontrolde biri sperm diğeri yumurtaya ait bitişik pozisyonda 2 çekirdeğin (pronükleus-PN) ve ek olarak ikinci bir kutup cisimciğinin gözlenmesi normal fertilizasyon, bu aşamadan ilk bölünmeye kadar ki gelişim aşaması zigot olarak adlandırılır. Bu sürenin geçirilmesi halinde çekirdekler birleşeceği ve görünür olmalarını sağlayan çekirdek zarı dağılacağı için döllenme olup olmadığı ya da anormal bir döllenme olmuşsa tespiti mümkün olmayacaktır. Fertilizasyon kontrolünde çeşitli anomaliler gözlenmesi de mümkündür. Bu anomaliler;

• MonoPN: Sadece 1 tane pronükleus gözlenmesi durumudur. Bu durumda yine de hücre bölünmesi ve embriyo gelişimi gözlenebilir fakat gelişen embriyo yüksek olasılıkla tek gamete ait kromozom setine sahip (haploid) olacağı için anöploid(sayısal kromozom anomalili) olacaktır. MonoPN durumu ayrıca çekirdek oluşum ve silinme zamanlamalarındaki asenkroniteden de kaynaklanabilir ve bu durumda normal kromozom setine (diploid) sahip olabilir. Fakat bu durumda da gelişen embriyolarda çoğunlukla gelişim problemleri gözlenmektedir.
• 3PN: Normalde haploid olması gereken gametlerden birinin diploid olması nedeniyle ya da mikroenjeksiyon sırasında 1’den fazla sperm enjekte edilmesi nedeniyle oluşabilir. Çoğunlukla embriyo gelişimi gözlense de, gelişen embriyo çok yüksek ihtimalle anöploid olacağı için transferi tercih edilmez.
• MultiPN: 3 ve daha fazla sayıda çekirdek gözlenmesi durumudur. Embriyo gelişimi olsa dahi kesinlikle transfer edilmez.
• Fragmented PN: Normal boyutta 2 çekirdeğin yanında 1 veya daha fazla küçük çekirdeğin gözlenmesi durumudur. Çekirdeklerin birleşmesi sürecinde düzelebilir ve normal embriyo gelişimi gözlenebilir.
• PN boyutları farklı: Çekirdeklerden birinin diğerinden farklı büyüklükte olması durumudur. Gelişen embriyolarda çoğunlukla gelişim problemleri gözlenmektedir.
• Ayrık PN: Çekirdeklerin arasında değişen miktarlarda mesafe olması, bitişik olmamaları durumudur. Çekirdeklerin sitoplazma içerisinde pozisyonunu düzenleyen mikrotübül yapılarındaki problemlerden kaynaklandığı düşünülmektedir. Aynı yapılar hücre bölünmesini de yönettiği için çoğunlukla embriyo gelişiminde problemler ve gelişim duraksaması gözlenir.

Embriyo kültürü basitçe rahim içi ortam şartlarının (in vivo) laboratuvarda oluşturulması(in vitro) ve bu suni ortamda embriyoların geliştirilmesi olarak tanımlanabilir. Bu ortam şartları;

• Vücut sıcaklığı olan 37 C ve kandaki seviye olan %5-6 karbondioksit oranını kontrollü olarak sağlayan inkübatörler
• Embriyoların besin ve hücresel yapıtaşı ihtiyaçlarını karşılayacak kültür solüsyonları
• Kültür sürecinde kontaminasyon riskini en aza indirecek steril çalışma alanları
• Partiküller ve uçucu organik bileşiklerden temizlenmiş laboratuvar havalandırması
• Bu şartların sağlanmasını ve devamlılığını kontrol edecek uzman personel

şeklinde özetlenebilir. Bu konunun detaylarını “Kalite Kontrol” başlıklı yazımızda bulabilirsiniz.

Embriyo kültüründe bu amaç için özel olarak üretilmiş ve gerekli kalite kontrol testleri (MEA-mouse embryo assay, LAL endotoxin test) yapılmış hazır solüsyonlar kullanılmaktadır. Bu solüsyonların ortak noktaları, embriyoların gelişim sürecinde ihtiyaç duyacakları enerji kaynakları (piruvat, glikoz), yapıtaşları (aminoasitler), pH tamponları (bikarbonat) ve mineraller ile destekleyici bileşenleri (EDTA, albumin) içermesidir. Genel olarak kültür sistemlerinde iki farklı yaklaşım söz konusudur; ardışık kültür ve mono kültür. Ardışık kültür ortamı yaklaşımında, embriyoların doğal ortamında, tüplerde ve rahim içerisinde farklı ortam şartlarına maruz kaldığı ve dolayısıyla laboratuvarda da aynı değişken şartların sağlanması gerektiği savunulmaktadır(back to nature-doğaya dönüş). Mono kültür yaklaşımında ise embriyonun gelişim sürecinde aynı kültür solüsyonu içeriğinden değişen ihtiyaçlarına göre farklı oranlarda kullanabilme yeteneği olduğu, bu nedenle solüsyon içeriğini gelişim dönemine göre değiştirmenin gereği olmadığı savunulmaktadır (let the embryo choose) bırak embriyo seçsin. Her iki yaklaşım da, kullanan laboratuvarın performansına bağlı olarak, benzer oranlarda başarılı sonuç vermektedir.

Embriyo gelişimi döllenmiş yumurtanın (zigot) ilk bölünmeyi geçirmesiyle (20-26.saat) başlar. Bu gelişim süreci klivaj ve blastokist dönemi olarak ikiye ayrılır;

Klivaj dönemi

Embriyonun 2 hücreden(OPU’dan sonraki 1.gün), 15-20 arası sıkıca birleşmiş hücre içeren (morula) aşamaya kadar (OPU’dan sonraki 4.gün) olan gelişimi klivaj(bölünme) dönemi olarak adlandırılır. Bu dönem adından da anlaşılabileceği gibi embriyonun mitoz bölünme ile hücre sayısını arttırdığı dönemdir. Fakat görünenin dışında hücre içerisinde muazzam metabolik faaliyetler, protein sentezi ve DNA kopyalama işlemleri gerçekleştirilmektedir. Bu dönemde gerçekleşen en önemli değişimlerden biri 8 hücre aşamasından sonra artık sperm genetik yapısının da embriyo gelişimini yönlendirmeye katılmasıdır (embriyonik genom oluşumu). Dolayısıyla sperm kaynaklı olası problemler çoğunlukla bu aşamadan sonra ortaya çıkmaktadır. Son yıllarda sürekli izleme sistemli cihazlar ile yapılan çalışmalar bu dönemdeki mitoz bölünme zamanlamalarının embriyonun ileri gelişim potansiyeli ve genetik yapısı ile ilgili bilgi verebileceğini göstermektedir. Bu dönemde embriyo kalitesi başlıca hücre sayısı, hücrelerin birbirlerine görece boyutları ve fragmantasyon (hücre parçacıkları) varlığı ve oranına göre belirlenir. Ek olarak gözlenen olası morfolojik anomaliler (vakuolsıvı dolu kesecik, granülasyon) embriyo kalitesini olumsuz etkileyebilirler. Buna göre klivaj dönemi embriyo kalitesi tanımlamaları aşağıdaki şekildedir;

1. Kalite: Eşit blastomer büyüklüğüne sahip, %0-5 oranında fragmantasyon içeren embriyo
2. Kalite: Eşit blastomer büyüklüğüne sahip, %5-10 oranında fragmantasyon içeren ya da blastomer boyutları hafifçe farklı, fragmantasyon içermeyen embriyo
3. Kalite: Blastomerler boyutları hafifçe farklı, %10-20 oranında fragmantasyona içeren veya blastomer boyutları ciddi oranda farklı, fragmantasyon içermeyen embriyo
4. Kalite: Blastomer boyutları ciddi oranda farklı, %10 üzerinde fragmantasyon içeren ya da blastomer sayısı net sayılamayan, %20 dan fazla fragmantasyona sahip embriyo

Blastokist dönemi

Morula aşamasındaki sıkıca birleşmiş hücreler arasında sıvı dolu boşluklar (blastosöl) ortaya çıkması ile başlayan gelişim aşaması blastokist olarak adlandırılır. Blastokist dönemi, klivaj döneminden, mevcut hücrelerin artık farklı görevler için başkalaşmaya başlamasıyla ayrılır. Hücrelerin bir kısmı embriyonun çeperlerini (trofektoderm) oluşturacak şekilde yayılırken, diğer bir grup hücre blastosöl içerisinde ayrı bir sıkı paketlenmiş hücre grubu (ICM-iç hücre kitlesi) oluştururlar. Blastokistin rahime tutunması (implantasyon) sonrası fetal gelişim evresinde trofektoderm hücreleri gebelik kesesini (gestational sac) oluştururken, ICM hücreleri bebeği (fetus)meydana getirirler. Blastokist dönemi embriyo kalitesi başlıca blastosöl hacmi ve ICM ile trofektodermdeki hücre yoğunluğuna göre belirlenir. Ek olarak gözlenen olası morfolojik anomaliler (vakuol, ayrı hücreler, dejenere hücreler) embriyo kalitesini olumsuz etkileyebilirler. Buna göre blastokist dönemi embriyo kalitesi tanımlamaları aşağıda belirtilen 3 başlık altındaki değerlendirmenin kombinasyonu ile yapılır;

Blastosöl hacmine göre:

1. Blastosölün oluşmaya başlaması, blastosöl hacminin embriyo hacminin yarısından az olması
2. Blastosöl hacminin embriyo hacminin yarısından fazla olması
3. Blastosöl hacminin embriyo hacminin tamamını kaplaması
4. Blastosöl hacminin embriyo hacminden büyük olması, zona’nın incelmesi
5. Zona çeperinin kırılarak embriyonun dışarı çıkmaya başlaması
6. Embriyonun tamamen zona’dan çıkması

ICM hücre yoğunluğuna göre:

1. Sıkı paketlenmiş çok sayıda hücre
2. Gevşek grup oluşturan az sayıda hücre
3. Çok az ya da hiç hücre olmaması

Trofektoderm hücre yoğunluğuna göre:

1. Pekçok sıkıca bitişik hücreden oluşan yapı
2. Az sayıda hücreden oluşan gevşek yapı
3. Çok az sayıda büyük hücreden oluşan yapı

Bu değerlendirmeye göre ideal blastokist kontrol zamanlamasında (IVF/ICSI sonrası 106-108.saat) en kaliteli blastokist 4AA, en düşük kaliteli olan ise 1CC olarak değerlendirilebilir.

Embriyo kalite değerlendirmesi, sadece mevcut embriyolar arasında gebelik oluşturma ihtimali en yüksek embriyonun seçimini sağlamakta yardımcı olmakta, gebelik sonrası oluşabilecek herhangi bir komplikasyonun ya da olası genetik anormalliklerin tespiti için yardımcı olamamaktadır. Bu gibi risklerin tespiti ve olası önlemler için ileri tetkik ve uygulamaların kullanılması gerekmektedir.

Embriyolar blastokist aşamasında iken trofekderm hücrelerinden salgılanan lizin enzimi yardımıyla zona çeperini inceltir ve yine trofektoderm hücrelerinin blastosöl içeriğindeki iyon konsantrasyonunu değiştirmesi sayesinde artan iç sıvı basıncının yardımıyla zona’yı yırtarak dışarı çıkarlar (hatching-tomurcuklanma). Embriyonun rahime tutunması (implantasyon) ancak embriyo zona’dan tamamen çıktıktan sonra gerçekleşebilir. Bu konuda yapılan çalışmalar, embriyoların laboratuvar ortamında kültürünün ve özellikle embriyo dondurma çözme işleminin zona’yı sertleştirici etkisi olduğunu ve dolayısıyla embriyonun çıkışını güçleştirdiğini göstermiştir. Ek olarak, ileri kadın yaşının ve zona tabakasında gözlenen anomalilerin de(kalın ya da düzensiz zona yapısı, ekstra iç zar-inner membrane varlığı gibi) benzer zorlaştırıcı etkiye neden olduğu düşünülmektedir. Bahsedilen olumsuzlukları aşabilmek için zona çeperinin transfer öncesi inceltilmesinin faydalı olduğu bilimsel çalışmalarla gösterilmiştir. Bu amaçla mekanik, kimyasal ve lazer uygulamaları tanımlanmış olmakla birlikte, içlerinde en etkin ve yaygın olarak kullanılanı lazer uygulamasıdır. Bu uygulamada, inverted mikroskoba monte edilen ve embriyoya minimum zarar verecek dozda lazer ışını sağlayan, bu işlem için özel üretilmiş cihazlar kullanılarak, hücrelere en uzak bir noktadan zona tabakasına yapılan lazer atışları ile inceltme yapılabilir. Çoğunlukla zona tabakasını yarı yarıya inceltecek ardışık 3 atışın yapılması yeterli olmaktadır. İleri derecede zona anomalilerinin mevcudiyeti halinde inceltme yerine tamamen açıklık oluşturulması da tercih edilebilmektedir. 3 ve üzeri blastokist seviyelerinde yapılacak lazer atışları, artık zonaya çok yakın olan trofektoderm hücrelerine zarar verebileceği için, bu aşamalarda kullanımı tercih edilmemektedir. Embriyo biyopsisi(Preimplantasyon genetik tanı-tarama): Tüp bebek tedavilerinde embriyo biyopsisi, preimplantasyon(embriyonun transferi ve rahime tutunması öncesi) dönemde, genetik olarak normal, sağlıklı embriyoların seçimi amacıyla uygulanan bir tekniktir. Endikasyonlarına göre iki tür genetik test yaklaşımı uygulanmaktadır. Preimplantasyon genetik tarama (PGS-Preimplantation Genetic Screening), kadın ve erkekte ya da ailelerinde bilinen bir genetik hastalık bulunmayan çiftlerin embriyolarında bulunan olası de-novo(sperm ya da yumurtadan kaynaklanan ve ilk kez embriyoda ortaya çıkan) mutasyonları (DNA anormallikleri) saptamak için kullanılır. Preimplantasyon genetik tanıda (Preimplantation Genetic Diagnosis) ise kadın ya da erkekten birinde ya da ailelerinde mevcut, bilinen bir genetik ve kalıtsal hastalığın bebeğe geçişini engellemek amacıyla bu hastalığa sahip olmayan embriyoların belirlenmesi amaçlanır. Bu genetik testlerin uygulandığı endikasyonlar ve uygulama aşamalarının seçimi ile ilgili Genetik başlıklı bölümü inceleyebilirsiniz. Her iki test yaklaşımının uygulanabilmesi için öncelikle tüp bebek yöntemi (KOH) uygulanması ve başarı şansını arttırabilmek için mümkünse çok sayıda embriyo elde edilmesi gerekmektedir. Tedavi sürecinde biyopsi, test endikasyonlarına göre 3 farklı aşamada uygulanabilir. Tüm biyopsi işlemleri, mikromanipulator donanımlı inverted mikroskoplarda ve biyopsi türüne uygun olarak üretilmiş mikropipetler kullanılarak uygulanır.